细胞培养操作

1、复苏细胞
以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。37度水浴摇晃尽快融化细胞，直接在冻存管内将细胞离心。离心转速以离心力150g(约900rpm)左右，1min为宜，弃上清，沉淀用新鲜培养基重悬后接种到10cm培养皿，显微镜下观察细胞并拍照，24h后换液一次。

2、细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1. 尽量吸干净T25瓶原培养基；

2. 加3-4ml 常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；

3. T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层；

4. 将培养瓶放入37度培养箱消化；

5. 消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化；

6. 混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

7. 加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里；

8. 补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

培养注意事项

1、收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 

2、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子

等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。 

3、用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置2-4h。 

4、贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900rpm-1000rpm 离心3min，弃上清。加5 mLPBS重悬细胞，再900 rpm-1000rpm离心3min，用新鲜的完全培养基重悬 细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。 

5、请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。 

6、建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 

7、该细胞仅供科研使用。 

8. 备 注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议1：2传代。 

9. 注 意：1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。