细胞周期检测试剂盒-蓝色荧光

细胞简介

1、细胞周期检测试剂盒是利用细胞内DNA能够和荧光染料结合的特性，细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。

2、细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

3、DAPI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。DAPI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。DAPI探针的最大激发波长为358 nm，最大发色波长为461 nm。

试盒组合

注意

染料-20°C避光保存;

RnaseA溶液-20℃保存。

储存条件

-20°C避光

有效期

一年

产品应用

流式细胞仪

适用样本

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、流式细胞仪

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

试剂准备

1、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X) )

2、或者HBSS (Hank's Balanced Salt Solution )。

耗材准备

1、离心管

2、吸头

3、一次性手套

使用方法

1、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2、最好使用含EDTA的细胞消化液。

3、洗涤细胞离心转速不可超过800×g。

4、乙醇固定时离心大概采用2000×g力5分钟，离心力太小可能部分细胞难以沉淀。

5、固定时在振荡器上轻轻振荡细胞，并缓慢滴加75%乙醇，直接加入会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为7O-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。

6 为防止不同批次细胞在实验时本身所出周期不同导致重复性差，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，不能是完全长满，一般在50~80%比较好。

7、分析的时候需要的是单个的细胞，400目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉，否则会出现人为的多倍体干扰，不过如果经验丰富的操作人员也可以gate掉。如果没有条件过滤，请在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色。

8、本试剂盒也可用于非固定细胞周期检测。

9、组织处理方法:用剪刀将组织剪成小块，用0.25%胰酶消化30min—1h，200—400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

10、每 100 ul PBS或HBSS缓冲液中加入10 ul DAPI染液，充分混匀，配制成染色工作液

11、收集样本细胞，细胞数量在5×10⁶~1×10⁶。

【注】

1、用300-800xg 力离心5分钟。

2、不同细胞离心力不同，以实验室常用离心力为准。

3、用冷 PBS洗涤细胞两次。

【注】

1、在300-800×g左右，离心5分钟，小心吸取上清，避免吸走细胞。

2、在15ml离心管中，用500 ul PBS重悬细胞。

【注】

1、此时要保证是好的单个细胞悬浮液。否则细胞会被成团固定。

2、滴加2-5 ml冷乙醇4°C固定过夜或-20℃固定1小时。

【注】

1、要非常慢的加乙醇，并轻微振荡防止细胞成团。

2、轻轻吹打混匀，避免细胞成团:不能太剧烈，防止细胞损伤成碎片。

3、到此步可以存放，-20C保存样品，1周内样品检测不受影响。

4、最长可以存放3周。

5、取 5X106细胞，在15ml锥形离心管中 1000×g 离心10分钟，弃上清，收集细胞。

6、用冷PBS洗涤细胞两次。

【注】

1、乙醇固定的细胞难以沉淀。可以在 PBS中添加1%的BSA或小牛血清改善。

2、或者稍微加大离心力。

3、用500 ul冷 PBS重悬细胞。

 【注】

1、可以用添加1%的BSA或小牛血清的PBS重悬。

2、加入 Rnase A 溶液20 ul，37°C水浴30分钟。

3、用400目细胞筛网过滤。 

【注】

1、无细胞筛网可以不做此步骤。

2、在1000×g离心10分钟，弃上清，收集细胞。

3、加入100 ul DAPI染色工作液重悬细胞，轻轻混匀后4℃避光孵育30分钟-1小时。

【注】

1、染色完成后宜在24h内完成流式检测。

2、加入400 ul PBS或HBSS缓冲液混匀。

3、流式检测结果。激发波长为358nm。发射波长461 nm。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理，