细胞周期检测试剂盒(7-AAD)

细胞简介

1、细胞周期检测试剂盒是利用细胞内DNA能够和荧光染料结合的特性，细胞各个时期其 DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。

2、细胞周期(cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由GO/G1期、S期、2期和M期组成。G1期:细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期:DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(GO期)，而GO期从 DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为GO/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出GO/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

3、7AAD为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。7-AAD染色后，假设GO/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组 DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

4、一般细胞周期检测试剂盒采用PI染色，但是由于PI的发射波长是<625nm,通常在FL2中检测,对FITC、PE的干扰大。PI由于波谱较宽，同时在FL2FL3中也能测，所以用了PI最多再加一个FITC，FL3就没法用了。PI还有一个重要的缺点是不容易清洗干净,使用后清洗流式细胞仪更加费时费物。

5、7-AAD细胞周期试剂盒有效的解决了这些弊端，7-AAD的发射波长是650nm,只占用FL3通道进行检测，FITC、PE两个通道受影响都小，可以做三色分析。

试剂盒组合

注意

1、染料短期2周内可以2-8°C保存。染料长期不用可以-20°C保存。避免反复冻融。

2、染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注

意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3、可以用手捂住使其融解或379C短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再

次凝固在吸头内壁产生损耗。

4、试剂拆封后请尽快使用完!

储存条件

-20°C避光

有效期

六个月

产品应用

流式细胞仪

适用样本

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、流式细胞仪

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

试剂准备

1、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X) )

2、或者HBSS (Hank's Balanced Salt Solution )。

耗材准备

1、离心管

2、吸头

3、一次性手套

使用方法

1、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2、最好使用含EDTA的细胞消化液。

3、洗涤细胞离心转速不可超过800×g。

4、乙醇固定时离心大概采用2000×g力5分钟，离心力太小可能部分细胞难以沉淀。

5、固定时在振荡器上轻轻振荡细胞，并缓慢滴加75%乙醇，直接加入会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为7O-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。

6 、为防止不同批次细胞在实验时本身所出周期不同导致重复性差，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，不能是完全长满，一般在50~80%比较好。

7、分析的时候需要的是单个的细胞，400目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉，否则会出现人为的多倍体干扰，不过如果经验丰富的操作人员也可以gate掉。如果没有条件过滤，请在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色。

8、本试剂盒也可用于非固定细胞周期检测。

9、组织处理方法:用剪刀将组织剪成小块，用0.25%胰酶消化30min—1h，200—400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

10、每 100 ul PBS或HBSS缓冲液中加入10 ul DAPI染液，充分混匀，配制成染色工作液

【注】

1、收集样本细胞，细胞数量在5×10⁶~1×10⁶个。

2、用冷PBS洗涤细胞两次。

3、在15ml离心管中，用500 ul PBS重悬细胞。

4、滴加2-5ml冷乙醇4℃固定过夜或-20°℃固定1小时。

5、取5X106细胞，在15ml锥形离心管中1000×g离心10分钟，弃上清，收集细胞。

6、用冷PBS洗涤细胞两次。

7、用500 ul冷PBS重悬细胞。

8、加入Rnase A溶液20ul,37°C水浴30分钟。

9、用400目细胞筛网过滤。

10、在1000×g 离心10分钟，弃上清，收集细胞。

11、用500ul PBS重悬细胞。

12、加入5 ul 7-AAD染液，充分混匀，，轻轻混匀后4C避光孵育30分钟-1小时。

13、流式检测结果。激发波长为488nm。发射波长647nm。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理，