Annexin V-FITC / PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

细胞简介

1、细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酷丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酷丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不件随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。

2、Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前,这使得Annexin V与PS的结合成为凋亡早期的一种重要测标志事件。

试剂盒组合

储存条件

2-8°C避光保存。长期保存于-20°C避光。

有效期

一年

检测原理

用标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-FITC。
正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，Propidium iodide (P)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，P能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。
将Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-FITC和PI 结合显色，而PI 则被排除在活细胞 (FITC 阴性)和早期亡细胞(FITC 阳性)之外。
在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞，为(FITC+/PI+ ); 而右下象限为凋亡细胞，显现 (FITC+ /PI-)。 (图1)

澳睿赛Annexin V-FITC细胞亡检测试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞，使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测

产品特点

方便 :  可用流式细胞仪或荧光显微镜检测;

快速 :  1小时内即可完成实验:

准确 :  能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例

检测方法

流式细胞仪或荧光显微镜

样本类型

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

1、PBS 

2、纯水        

3、移液器及吸头

4、离心机   

5、流式细胞仪或荧光显微镜。

使用注意事项

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2、Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。

3、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。

使用Annexin V-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。

4、如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并20O×g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合。

5、流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1×105。

6、如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。

7、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色;处理贴璧细胞时要小心操作，
尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多;消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，
甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，
待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS的结合。

8、成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，
把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。

9、有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度很低，难以染色，此时不适合用Annexin V方法检测凋亡。

样品染色

1、离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

2、用冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽PBS。

3、用400ul 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1×10fcells/ml。

4、在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。

5、加入10ul PI染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。

6、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测

流式细胞仪分析

1、经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为488nm。

2、按照常规的流式凋亡检测的操作即可。Annexin V-FITC的绿色荧光信号可以通FL1(FITC接收器）通道检测;PI红色荧光在620nm，通过FL2（Propidium iodide接收器）通道或FL3通道检测。

注 : 具体流式设置按常规方法即可。也可联系本公司索取供参考的详细步骤。

荧光显微镜观察

1、滴加30-50ul用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞

注: 对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后，滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，
然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400ul Annexin V结合液于孔中。再加入5ulAnnexin V-FITC染色液与10ul Propidiumlodide染色液，混匀。避光室温反应10分钟。

2、在荧光显微镜下用双色滤光片观察。使用荧光显微镜上的FITC滤镜（蓝光)，Annexin V-FITC染色阳性的细胞将在细胞膜表面呈现明亮的苹果绿色。使用Rhodamine滤镜（绿光），

Propidiumlodide染色阳性的细胞则会在整个胞质内呈现不同强度的黄-红色。
早期凋亡细胞不会被Propidiumlodide染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示出黄-红色的胞质，红色的胞核和环绕细胞的绿色胞膜。
在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。

常见问题分析

1、实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。

2、确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来除这一情况。

3、贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca*离子，结合液中含有Ca*，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。

4、细胞离心用冷PBS洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。

5、Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO,进入后形成CaCO会产生沉淀，从而减少游离的Ca2*，导致实验的结果不佳。

6、污染其他的缓冲液。如吸取PBS后不更换Tip头会导致游离的Ca*的减少，从而导致实验的结果不佳。

7、阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。

实验过程中阳性率偏高。

8、细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。
建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验。

9、细胞操作不当。贴璧细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。

10、凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

注意事项

1、请在使用前仔细阅读并参考该说明书。

2、本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

3、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，请注意避光存放和使用。

4、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

5、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

6、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂

7、所有试剂应小心保存和使用，避免皮肤或粘膜与试剂接触，如果不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

实验完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。