CFSE-PI双染细胞毒性检测试剂盒

细胞简介

CFSE/PI双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料CFSE(CFDA-SE)和PI对细胞进行染色，利用CFSE标记靶细胞，PI标记死的靶细胞来区分不同的细胞，活的靶细胞成绿色，死的靶细胞成红色和绿色，从而检测细胞毒性作用。

根据不同的实验方案设计，可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T细胞或NK细胞介导的细胞毒作用。

CFDA-SE是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。CFDASE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFDASE 在结构上将酚羟基部位改造成AM体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，进入细胞内的CFDASE 的AM部位能被细胞内酯酶水解生成CFSE，通过共价结合赖氨酸侧链的氨基而掺入细胞内和细胞表面的蛋白，且结合后发出强的绿色荧光。CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。

CFSE毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

CFSE/PI标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。

CFSE标记细胞呈绿色荧光，荧光波长:入ex=496 nm, 入em=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为516nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1detection channel。PI标记细胞呈红色荧光，流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为647nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL2 detection channel.

CFSE标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外，还可单染后用于细胞增殖检测，或者用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

试剂盒组成

存储条件

2-8°C避光保存

【注】

1、开盖后组份按要求条件保存。

2、拆封后请尽快使用完！

有效期

一年

检测方法

1、流式细胞仪。

2、激光共聚焦。

3、荧光显微镜。

适用类型

动物细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、带有450mm滤光片的酶标仪

2、CO2培养箱

试剂准备

1、纯水

2、PBS

试剂准备

1、移液器

2、吸头

3、96孔培养板

使用方法

1、旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2、染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。

3、CFSE母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，三-20°℃冷冻保存。

4、冬天气温较低时CFSE溶解液会凝固，可先在37C水浴至溶解液完全融解后再进行配制，配制过程中注意避免溶液凝固，保持温度至CFSE 溶解完全。

5、CFSE工作液应现配现用，不能提前配制，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。

6、CFSE易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。

7、CFSE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。正式实验前，建议先做几个孔摸索染色浓度和加入CFSE试剂后的培养时间。

8、荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

9、以下实验步骤仅供参考，请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。

10、必须设置全阴，CFSE单标，PI单标的靶细胞的参照以设置流式。

细胞CFSE染色

1、 根据需要检测的细胞样品数，用HBSS将CFSE母液200-4000倍稀释，配制成CFSE染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

2、将培养好的待测靶细胞消化后收集，用PBS洗涤2次。

3、将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/ml。

4、在37℃培养箱中避光孵育15-30分钟。

5、加10倍体积的含血清培养基，400×g离心5分钟。

6、离心后去上清，收集细胞，用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入培养基重悬细胞。

7、在37C培养箱中孵育20-30分钟。

细胞模型制备

1、收集待检测的靶细胞。

2、进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。

细胞检测

1、收集制备好的毒性处理过的细胞模型。

2、用500 ul HBSS重悬细胞，加入10 ul PI染色液，混匀。

3、在2-8°C避光孵育5-15分钟。

4、在400×g离心5分钟收集细胞。

5、用500 ul HBSS或PBS重悬细胞。

6、取 500 ul细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

7、根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被PI染上会出现在CFSE+PI+区域，未杀伤的在CFSE+PI-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底.避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。