方法简介

金少源实验室分离的人退行性椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

金少源实验室分离的人退行性椎间盘髓核细胞经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

人退行性椎间盘髓核细胞体外培养周期有限；建议使用金少源配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

细胞培养状态 

发货时发送细胞电子版照片  

使用方法

人退行性椎间盘髓核细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形，在金少源技术部标准操作流程下，细胞可传5代左右；3代以内状态最佳；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。  

1、取出T25细胞培养瓶
用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。  

2、贴壁细胞消化 

1) 吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3) 用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4) 待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

5) 用吸管轻轻吹打混匀、分散细胞，按实验需求接种于实验器皿内，然后补充适量新鲜的完全培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

6) 待细胞状态稳定后，用于实验；可以每2-3天换液一次新鲜的完全培养基。  

3、细胞收货脱落

1) 收集所有细胞悬液，1000rpm，离心5min，保留沉淀；

2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液0.5mL至离心管中，重悬沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱静置5-7min)；消化完向离心管内加入5ml完全培养基终止消化；

3) 经1000rpm，离心5min，丢弃上清，用5ml完全培养基(补加1%FBS，促进贴壁)重悬沉淀，接种于新的培养瓶内；

4) 待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基(37℃预热)；

5) 原瓶内贴壁细胞按正常消化处理。

4、细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

注意事项

1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月。  

2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。  

3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。  

4、建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和金少源技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。   

5、该细胞只可用于科研   

1) 本产品未通过直接用于活体动物和人的审核；  

2) 本产品未通过用于活体诊断的审核；   

备 注：由于实验所用试剂、操作环境及操作手法的不同，以上方法仅供各实验室参考。