细胞培养操作

1、复苏细胞

以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第三天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代

如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

a) 细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；。          

b) 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。

c) 弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

d) 待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、细胞冻存

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

a) 细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。

b) 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。

c) 用适量的冻存液（FBS：DMSO=9 ：1）重悬细胞，并放置于冻存管中。

d) 先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

培养注意事项

1、收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，

确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由 客户自行承担。 

3、用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置 2-4h。 

4、贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3min，弃上清。加5mL PBS重悬细胞，再900rpm-1000rpm 离心3min，用新鲜的完全培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。 

5、请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。 

6、建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 

7、该细胞仅供科研使用。 

8、备 注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培 养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

9、注 意：1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。