细胞培养操作

1、复苏细胞
以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。          

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 -3min（视细胞消化情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

培养注意事项

1、收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好 ，培养液是否有漏液 、浑浊等现象 ，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2、仔细阅读细胞说明书 ， 了解细胞相关信息 ， 如细胞形态 、 所用培养基 、 血清比例、 所需细胞因子等 ，确保细胞培养条件一致 ，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题 ，责任由 客户自行承担。

3、 用 75%酒精擦拭细胞瓶表面 ， 显微镜下观察细胞状态。 因运输问题 ， 部分细胞由于温度 变化及 剧烈碰撞死亡破碎形成碎片 ，是正常现象。观察好细胞状态后 ， 75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于37℃培养箱放置 2-4h。

4、 贴壁细胞可以消化 ，悬浮细胞直接混匀收集细胞 ， 900 rpm-1000 rpm离心3 min ，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞 ，再900 rpm-1000 rpm离心3 min ， 用新鲜的完全培养基重悬细胞 ，并接种到新的培养瓶或培养皿中 ，置于培养箱中进行培养。

5、请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6、建议客户收到细胞后前 3 天各拍几张细胞照片 ，记录细胞状态 ，便于和我司技术部沟通 交流。 由 于运输的原因 ，个别敏感细胞会出现不稳定的情况 ，请及时和我们联系 ， 告知细胞 的具体情况 ， 以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7、该细胞仅供科研使用。

8、备 注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞 ，请换用按照说明书细胞培 养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 1： 2 传代 。

9、注 意：1 : 2传代就是 1 个 T25 瓶传 2 个 T25 瓶或者 2 个 6cm 皿。不是 1 个 T25 瓶传 2 个 10cm 皿。