Annexin V-EGFP / PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

细胞简介

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酷丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酷丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不件随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。

Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前,这使得Annexin V与PS的结合成为凋亡早期的一种重要测标志事件。

试剂盒组合

各组份储存条件

染色液 2-8℃避光保存

结合液 2-8℃保存

【注】

1、长期不用可以-20℃保存。

2、Annexin V-EGFP 染色液避免反复冻融。

3、Annexin V-EGFP 染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存

有效期

一年

检测原理

用标记了ECFP的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidium iodide (PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将 AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(EGFP-PI-);右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（EGFP+ PI+ );而右下象限为凋亡细胞，显现(EGFP+/PI)。(图1)澳睿赛Annexin V-EGFP 细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检凋亡细胞，使用流细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

图 1、Annexin V-EGFP 凋亡检测试剂盒原理

产品特点

方便 :  可用流式细胞仪或荧光显微镜检测;

快速 :  1小时内即可完成实验:

准确 :  能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例

检测方法

流式细胞仪

荧光显微镜

激光共聚焦

样本类型

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

1、流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦 

2、离心机 

3、移液器 

4、冰箱 

5、冰盒

仪器

1、PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））

2、phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4137mM NaCl和3mM KCl）

3、或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution；  With：Calcium Magnesium Glucose； Without：Phenol Red。Components：CaCl2(anhydrous) 140mg/L(1.261mM)、MgCl2-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCl 400mg/L(5.333mM)、KH2PO4 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous) 48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)

耗材

离心管 

吸头

使用注意事项

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。 

2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。 

3、Annexin V-EGFP 和Propidium iodide 是光敏物质，在操作时请注意避光。 

4、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。 

不需要固定细胞，否者可能对结果产生干扰。 

5、如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有 EDTA 的缓冲剂并 200×g 离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V 结合。 

6、流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于 1×105。 

7、如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用 PBS  洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-EGFP，最终导致染色失败。 

8、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短， 细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-EGFP 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA 影响 Annexin V 与 PS 的结合。 

9、成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上 PS 的密度、发生凋亡时 PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要

样品染色

1、离心收集悬浮细胞。离心机 300-500g 力，2-8°C，离心时间 5 分钟，弃培养基。（贴壁细胞用不含 EDTA 的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性）。

【注】

1、检测贴壁细胞时，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因为可能存在一些掉下来的凋   亡细胞，在胰酶消化后，再将这些上清加回去，一起检测，结果更加准确。 

2、离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。 

3、用冷 PBS 洗涤细胞两次

【注】

1、300g-500g，2-8°C，离心时间 5 分钟收集细胞 

2、用 400ul 1X Annexin V 结合液悬浮细胞，浓度大约为 1 X 106 cells/ml。 

3、在细胞悬浮液中加入 5ul Annexin V- EGFP 染色液，轻轻混匀后于 2-8°C 避光条件下孵育 15 分钟。 

4、加入 5-10ul PI 染色液后轻轻混匀于 2-8°C 避光条件下孵育 5 分钟。 

5、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测

【注】

1、染色完成后要尽快上机检测，因为细胞在Annexin V 结合缓冲液中存活时间不会太长

流式细胞仪分析

2、上机检测前，须用待测细胞制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：

① 空白管，没有染色的细胞：不加 Annexin V-EGFP，不加 PI。用于调节电压。 

② 单染管，Annexin V- EGFP 单染细胞：用明显凋亡的细胞，仅用 Annexin V- EGFP 染色细胞。用于调节补偿。 

③ 单染管，PI 单染细胞：仅用 PI 染色细胞。用于调节补偿。 

④ 检测管：待测的处理细胞，加 Annexin V- EGFP，加 PI。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

【注】

1、具体流式设置按常规方法即可。也可联系本公司索取供参考的详细步骤。

2、经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为 488nm。按照常规的流式凋亡检测的操作即可。

3、Annexin V- EGFP 的绿色荧光发射波长 530nm，信号可以通过 FL1（FITC 接收器）长

通道检测

1、PI 红色荧光在 620nm，通过 FL2（Propidium iodide 接收器）通道或 FL3 通道检测

荧光显微镜观察

1、滴加用 Annexin V-EGFP/PI 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

【注】

1、对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。 

2、也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于 24 孔或 12 孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。 

3、细胞染色在细胞培养板内进行。先用 PBS 冲洗两次，加入 400μl Annexin V 结合液于孔中。
再加入 5μl Annexin V-EGFP 染色液与 10μl Propidium Iodide 染色液， 混匀。避光室温反应 10 分钟。 

4、在荧光显微镜下用双色滤光片观察。使用荧光显微镜上的 FITC  滤镜（蓝光），

5、Annexin V-EGFP 荧光信号呈绿色；使用 Rhodamine  滤镜（绿光），PI 荧光信号呈红色，Propidium Iodide 染色阳性的细胞则会在整个胞质内呈现不同强度的黄-红色，
早期凋亡细胞不会被 Propidium Iodide 染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示出黄-红色的胞质，红色的胞核和环绕细胞的绿色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。