细胞凋亡形态学检测试剂盒
细胞简介

1、细胞凋亡形态学检测试剂盒可用于细胞凋亡检测，也可用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色，染色后可用荧光显微镜检测或流式细胞仪检测。

2、本试剂盒细胞染料是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的染料比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将染料排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。染料的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm:染料和双链DNA结合后，最大激发波长为 350nm，最大发射波长为461nm。本染色试剂盒可直接用于活细胞或组织染色，也可用于固定细胞或组织染色。

试剂盒组合

储存条件

-染色液2-8℃保存

试剂B-20℃避光保存

【注】

1、染色液长期不用可以-20℃保存。

2、染色液避免反复冻融。需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。

试剂拆封后请尽快使用完。

仪器准备

1、荧光显微镜或激光共聚焦

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

5、冰盒

有效期

1年

适用样本

悬浮细胞 

贴壁细胞

试剂准备

1、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液(1X))( phosphate buffersaline/Dulbecco’s PBS:约含8mM NaHPO.、2mM KHEPO.、137mM NaCl和3mM KCl)

2、或者HBSS(Hank's Balanced Salt Solution: With: Calcium Magnesium Glucose+Without: Phenol Red.Components:CaCl(anhydrous) 140mg/L(1.261mM) 、 MgCl:-6HLO100mg/L(0.493mMD、MgSO.-7HLO 100mg/L.(0.407mMD)、KCl 400mg/L (5.333mM) 、KH.PO。60mg/L(O.441mM)、NaHCO。350mg/L.(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、NaHPO.(anhydrous)48mg/L.(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)

使用方法

1、染色缓冲液的配制:

2、根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100uL试剂C加900uL无菌去离子水稀释，混匀即成染色缓冲液。

3、收集样本细胞，细胞数量在10X10°个以内。3、用PBS洗涤细胞两次。

4、用500 u L-1ml 染色缓冲液将细胞重悬。5、加入5-10ul染色液A。

5、加入5-10ul染色液B。

6、轻轻混匀后4℃避光孵育10-20分钟。8、用PBS洗涤细胞。

7、用流式细胞仪或荧光显微镜检测结果。染料A-DNA复合物的最大激发波长为350nm，

8、大发射波长为 460nm，染料B-DNA 复合物的最大激发和最大发射波长分别为 488nm和615nm

耗材准备

1、离心管

2、吸头

使用注意事项

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3、染色后立即进行分析。

4、染色时间根据不同样本的实际染色结果做相应调整。

5、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。

6、本染色液可用于培养细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片的检测。石蜡切片用常规方法脱蜡、分化、冰冻切片用冰丙酮固定后检测。

7、根据样本情况和下游的检测仪器选择合适的染色方法，只要在染色时染色工作液能充分覆盖细胞样本即可。

8、活细胞原位染色可能需要较长时间，可将染液加入后避光孵育30分钟-2小时，或者调高染色工作液的浓度。

9、以下以培养细胞的涂片的荧光显微镜检测为例，实际使用时以样本情况为准，大多数时候使用时是在培养器皿上原位染色。细胞染色不需要固定，也可以固定后染色。

10、染色工作液的配制:

11、根据样品数用PBS将细胞染色液20-50倍稀释，配制成染色工作液。

12、细胞涂片的制备:

贴壁细胞，可将盖玻片放于培养器皿中，让培养细胞长于玻片上，然后用药物诱导细胞凋亡后取出，用4%多聚甲醛固定5min。也可其他方式培养后收集细胞制作涂片检测。

对于悬浮细胞，用药物诱导细胞凋亡后，500-1000g离心5分钟收集细胞，

用PBS洗2次,收集调整细胞数为1X10°/ml,涂片或用离心涂片,用4%多聚甲醛固定5min;

13、用PBS洗涤涂片两次。

14、加适量染色工作液于涂片上，室温避光染色5-20分钟

【注】

1、原位染色时按平时培养基用量加入染色液即可。

2、用纯水10倍稀释的试剂B洗涤涂片。

3、用荧光显微镜检测结果。染料-DNA复合物的最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。

结果分析

1、染色后，置于荧光显微镜下，选用340-350nm 的激发光观察:正常细胞的细胞核呈弥散均匀蓝色荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光，颜色有些发白。如果见到3个或3个以上的 DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞，凋亡细胞相对于正常细胞体积变小，变形。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。