Hoechst33342/PI双染试剂盒

产品简介

1、Hoechst33342/PI双染细胞凋亡检测试剂盒是采用DNA探针双染细胞核的方法检测细胞的状态。

2、Hoechst33342染色液A可以透过正常细胞膜，而细胞凋亡后，细胞膜对Hoechst33342染色液A的通透性增加，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA 的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA 结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。

3、PI染色液B不能透过细胞膜，对正常细胞和凋亡细胞不能染色，而对坏死细胞可以染色。

4、用两种染色液对细胞进行双染后,使用流式细胞仪或荧光显微镜即可对细胞状态进行检测。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为:正常细胞为低蓝色/低红色(A+/B+)，凋亡细胞为高蓝色/低红色(A++/B+)，坏死细胞为低蓝色/高红色（A+/B++)

试剂盒组合

各组份储存条件

A液和B液-20℃避光保存，

C液 2-8℃保存

储存条件

2-8°C避光保存

【注】

1、开盖后组份按要求条件保存。

2、拆封后请尽快使用完

有效期

一年

Hoechst33342和PI荧光光谱

检测方法

流式细胞仪

荧光显微镜

激光共聚焦

样本类型

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、荧光显微镜/激光共聚焦/流式细胞仪

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

5、冰盒

试剂准备

1、PBS缓冲液( pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X))( phosphate buffer saline/Dulbecco's PBS:约含8mM NazHPO:、2mMKHPO4、137mM NaCI和3mM KCI)

2、或者HBSS(Hank's Balanced Salt Solution: With:Calcium MagnesiumGlucose: Without: Phenol Red。Components:CaClz(anhydrous)140mg/L(1.261mM)、MgClz-6HzO 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7HzO100mg/L(0.407mM)、KCI 400mglL (5.333mM)、KH,PO460mglL(0.441mM)、NaHCO,350mg/L(4.167mM)、NaCl8000mg/L(137.931mM)、NagHPOa(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)

耗材准备

1、离心管

2、吸头

使用注意事项

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3、标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。

4、染色浓度和时间根据不同样本的实际染色结果做相应调整。

5、染色后立即进行分析。

6、 染色缓冲液工作液的配制:

7、根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100 uL试剂C加900 uL无菌纯水稀释，混匀即成1*染色缓冲液工作液。

8、收集样本细胞，细胞数量在1X106个以内。

9、 用PBS洗涤细胞两次。

10、用500 u L-1ml染色缓冲液将细胞重悬。

11、 加入5-10ul Hoechst33342染色液A。

12、 轻轻混匀后4℃避光孵育10分钟。

13、 加入5-10ul PI染色液B。

14、轻轻混匀后4℃避光孵育5-10分钟。

15、 用PBS洗涤细胞。

16、用PBS重悬细胞。

17、用流式细胞仪或荧光显微镜检测结果。HO33342用紫外光激发，PI用蓝光激发。Hoechst33342-DNA复合物的最大激发波长为350nm，最大发射波长为460nm，PI-DNA复合物的最大激发和最大发射波长分别为488nm和615nm。

观察结果

1、正常细胞为低蓝色/低红色(A+/B+)，凋亡细胞为高蓝色/低红色（A++/B+)，坏死细胞为低蓝色/高红色（A+/B+十)。

2、形态学:正常细胞核形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒:凋亡细胞的核呈亮蓝色，或核呈分叶状，碎片状。坏死细胞核红色。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。