AO-PI双染试剂盒

产品简介

1、AO/PI双染细胞凋亡检测试剂盒是采用DNA探针双染细胞核的方法检测细胞的状态。叶啶橙(Acridine Orangc，AO)为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中 DNA和RNA结合量存在差别,复合物可发出不同颜色的荧光,红色荧光为AO-DNA(F>600nm),绿色荧光为AO-RNA或单链 DNA(F>530nm)。

2、在荧光显微镜下观察，叶啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;而在调亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。叫啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒;而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

3、Propidium Iodide是一种 DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和 630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。

试剂盒组合

各组份储存条件

A液和B液-20℃避光保存，

C液 2-8℃保存

储存条件

2-8°C避光保存

【注】

1、长期不用可以-20°C保存

2、染色液避免反复冻融。需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20°C保存。试剂拆封后请尽快使用完

有效期

六个月

AO和PI荧光光谱

检测方法

流式细胞仪

荧光显微镜

激光共聚焦

样本类型

悬浮细胞

贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、荧光显微镜/激光共聚焦/流式细胞仪

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

5、冰盒

试剂准备

1、PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））

2、或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材准备

1、离心管

2、吸头

2、一次性手套

使用注意事项

1、 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3、本染色试剂盒可用于细胞、细胞涂片等。以下以悬浮培养细胞的荧光显微镜检测为例，其他方法请参阅相关资料。

4、贴壁细胞可以消化下来染色，也可以直接原位染色。

染色工作液配制

1、根据样品数，按下列比例配制染色缓冲液。取100uL试剂C用900uL纯水稀释，充分混匀即成染色缓冲液。

2、每 500uL染色缓冲液加入5ul AO染色液和10ul PI染色液，充分混匀，即成染色工作液

【注】

1、不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。

悬浮细胞染色

1、收集样本细胞，细胞数量在10X10^5个以内。

2、用PBS洗涤细胞两次。

3、用500 uL染色工作液将细胞重悬。

4、轻轻混匀后4℃避光孵育10-20分钟。

5、用PBS洗涤细胞。

6、用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。

7、贴壁细胞原位染色;

8、用PBS洗涤细胞2次。

【注】

1、注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。

2、细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。

3、37℃孵育细胞10~20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。

【注】

1、若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。

2、吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2~3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。

结果分析

1、在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检:

2、AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。

3、当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。