活细胞-死细胞双染试剂盒

细胞简介

1、活细胞-死细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/EthD-I双染细胞的方法染色活细胞和死细胞。

2、Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calccin-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。

3、作为核染色染料的EthD-Io<(Ethidium Homodimer 1)不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发:488nm，528nm，发射:617 nm)，因此 EthD-I仅对死细胞染色。

由于Calcein-DNA和 EthD-I-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发,仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein, AM和EthD-I经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
试剂盒组合

各组份储存条件

1、染色液A -20℃避光保存

2、染色液B和试剂C 2-8℃保存

【注】

1、长期不用可以-20℃保存。

2、染色液Calcein AM注意防潮:避免反复冻融。

3、染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

4、注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37C短时间水浴。

5、试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。

6、试剂拆封后请尽快使用完。

储存条件

-20°C避光保存

【注】

1、开盖后组份按要求条件保存。

2、拆封后请尽快使用完。

有效期

一年

适用样本

细胞

Calcein AM和EthD-I荧光光谱

检测方法

1、流式细胞仪

2、激光共聚焦

3、荧光显微镜

样本类型

悬浮细胞

贴壁细胞

仪器准备

1、流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

4、冰盒

适用样本

1、PBS缓冲液(pH7.4,实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液(1X))(phosphatebuffer saline/Dulbecco's PBS:约含8mM Na,HPO4、2mM KH,PO,、137mM NaC1和3mM KC1)

2、或者HBSS (Hank's Balanced Salt Solution: with:Calcium Magnesium Glucose: Without: Phenol Red。Components: CaClz(anhydrous)140mg/L(1.261mM)、MgCl,-6H,O 100mg/L(0.493mM)、MgSO,-7HyO100mg/L(0.407mM)、KC1 400mg/L (5.333mM)、KH,PO,60mg/L(0.441mM)、NaHCO, 350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na;HPO4(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)

仪器准备

1、离心管

2、吸头

3、一次性手套

使用注意事项

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2、染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

3、微量试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

4、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

5、由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完6、Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。

7、试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

以下实验步骤仅供参考，以实际的样本和文献参考步骤进行调整。可以染色悬浮培养细胞、贴壁细胞、制备的细胞爬片、涂片等原位染色

染色工作液的配制

1、根据样品数按下列比例配制染色工作液。

2、用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。

3、每 10ml HBSS 缓冲液或无血清培养基中加入100ul稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。

4、每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200ul稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B

【注】

1、由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。Calcein-AM染色时间一般15-40分钟。EthD-I染色时间一般1-5分钟。

 一般细胞Calcein-AM染色时终浓度为试剂盒中母液的1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至500倍稀释或者延长染色时间。EthD-I的使用终浓度为试剂盒中母液的1000-8000倍稀释，常用2000-5000倍。

Calcein-AM溶液和PI溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。

3、注意EthD-I的浓度在染上色的前提下尽可能低，否者可能有细胞毒性，使原本的活细胞染上色。

可以不用本试剂盒的染料稀释液，直接用HBSS、无血清培养基配染色工作液。不可以用含血清培养基配制。

4、Calcein-AM染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

收集样本细胞

【注】

1、根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时,可以先用胰酶-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。也可以直接原位染色检测。

用PBS洗涤细胞两次

【注】

1、由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。

2、贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。

用200ul染色工作液A将细胞重悬

【注】

1、Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。

2、有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein AM内来增强其水溶性.制备染色工作液前,取一管需要用的Calcein AM内加入20%Pluronic F127,使 PluronicF127的终浓度为0.02%。

3、含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可长期保存，现配现用。

用200ul染色工作液A将细胞重悬

【注】

1、分开染色，Calcein AM染色15-30分钟，EthD-I染色1-5分钟即可。

2、同时染色时，一定要注意EthD-I浓度，防止染色活细胞。

3、如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（probenecid，1-2.5 mM）或者苯磺唑酮(sulfinpyrazone，0.1-0.25 mM）到孵育体系内以降低染料Calcein泄露到胞外

用PBS洗涤细胞

【注】

1、如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。

2、用200ul染色工作液B将细胞重悬。

3、在室温或37C避光孵育2-5分钟。

4、用PBS洗涤细胞。

5、用适量PBS重悬细胞。

6、用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。

【注】

1、在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察

结果分析

1、荧光显微镜下，使用490主10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。用528 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，

避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并

彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理，