LDH细胞毒性检测试剂盒

细胞简介

LDH 乳酸脱氢酶检测试剂盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体将显色剂还原生成显色物质，在450nm处的OD值与LDH成正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的LDH漏出情况。

LDH(乳酸脱氢酶）是存在于细胞质的一种酶，LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。当细胞膜受到损伤时，LDH会释放到培养基中。由于释放出的LDH稳定,检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。

试剂盒组成

 各组份储存条件

1、LDH反应液2-8℃避光保存

2、提取液2-8℃保存

储存条件

2-8°C避光保存

【注】

1、开盖后组份按要求条件保存。

2、拆封后请尽快使用完。

有效期

一年

 检测方法

 1、酶标仪。

 2、分光光度计。

样本类型

1、悬浮细胞

2、贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、酶标仪/分光光度计

2、离心机

3、移液器

4、冰箱

5、冰盒

试剂准备

1、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X)

( phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS:约含8mM Na2HPO4、2mM KHPO、137mMNaCl和3mM KCl。

2、或者HBSS(Hank' s Balanced Salt Solution: With: Calcium Magnesium GlucoserWithout: Phenol Red.Components:CaCl=(anhydrous) 140mg/L(1.261mM) 、MgCl:-6HO100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L.(0.407mM)、Kcl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4。60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、 NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4.(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L.(5.556mM) )。

试剂准备

1、离心管

2、 吸头

3、一次性手套

4、96孔板

使用方法

1、LDH反应液短期存放于2-8℃，长期存放请分装后-20℃避光保存。

2、LDH反应液避免反复冻融。

3、LDH反应液冻存后溶解时注意重新混匀。

4、冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活。建议样品准备好后尽量当天完成测定。

5、因为每种细胞的LDH量不同,建议通过预实验确定高LDH对照和低LDH对照的吸光度差异最大的细胞数。

6、培养基中动物血清中的LDH会增加背景吸收，建议设置一个培养基背景对照来校正。

7、动物血清中的LDH活性较高时，可以通过降低血清浓度来减小其中的LDH造成的背景吸收，一般将血清浓度降低到5%会显著减小背景。

8、细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。

9、若需准确计算出漏出的LDH酶活性的绝对活性，请选用贝博其它货号的试剂盒。

10、不同样本的LDH漏出情况不一样，需要做预实验确定加入LDH反应液后的孵育时间。

11、以下以96孔板培养为例，如果是使用的其它类型的培养板，以实际为准，等比例调整吸入对应规格的试剂即可。

12、因为每种细胞的LDH量不同，为了得到最好的显色效果，推荐做预实验确定最佳细胞量。没条件做细胞数量优化的话，可以选择较高细胞量实验。

关于对照孔设置

一般按以下设置对照孔，仅供参考，也可以根据实验需要自己设置:(例如加入100ul细胞悬液，加入药物母液1-10ul。

背景空白对照

1、保留两个或三个孔，使其不添加细胞和药物以用作背景空白对照。

2、向每个孔中添加110uL新鲜培养基。

待测样品空白对照

1、使两孔或三孔没有细胞，添加培养基和待测药物样品用作样品空白对照。

2、加入60puL新鲜培养基+50uL待测药物样品。

低LDH对照

1、使两孔或三孔含有细胞，无添加药物，用作低LDH对照。

2、加入60uL新鲜培养基+50uL细胞悬液。

高LDH 对照

1、使两或三孔含有细胞，无添加药物，加入LDH提取液用作高LDH对照。

2、加入50uL新鲜培养基+50uL细胞悬液+10ul LDH提取液。

高LDH空白对照

1、使两孔或三孔不含细胞，无添加药物，加入LDH 提取液用作高LDH 空白对照。

2、加入100uL新鲜培养基+10ul LDH提取液。

表A

LDH 测定

1、吸取50 ul用培养基稀释过的细胞悬液至96孔板中。

【注】

1、用贴壁细胞时,接种细胞至96孔板过夜预培养,换成新的50 ul培养基后,进行操作步骤2。

2、加入50 ul含有药物的培养基（按表A)。

3、在37°C CO,培养箱内培养合适的时间。

4、在高LDH对照孔、高LDH空白对照孔中加入10 ul LDH提取液后，在样品、样品空白、低LDH对照孔和背景空白孔中加入10 ul培养基（按表A)，在37℃ CO,培养箱内培养30-45分钟。

【注】

1、加入LDH提取液的孔用移液器轻轻吹打混匀，中间每隔10分钟用移液器轻轻吹打混匀。

2、LDH提取液比较粘稠，容易吸附在吸头壁，一定要注意有效加入培养基并充分混匀。

3、可以根据样品数量，按照每50 ul培养基+10 ul LDH提取液的比例预先多配制一些提取液的工作液，放大体积后提取液的终浓度会更加准确。

4、如果是其它培养体系，LDH提取液按孔中液体量10%加入即可。

5、96孔板离心2 min (250×g)，使悬浮细胞沉淀。

6、从每个孔中吸取100 ul上清液至另一个新的96孔板中。

【注】

1、为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。

2、在新的96孔板每个孔中加入10 ul LDH 反应液B后，在室温避光的条件下培养30分钟-4小时。

【注】

1、培养时间与预实验在每孔中加入10ul LDH 反应液，采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应一致。

2、一般45分钟-60分钟反应时间即可。

3、如果是其它培养体系，LDH反应液按孔中液体量10%加入即可

4、用酶标仪测定450 nm的吸光度

LDH计算

1、计算待测样品孔-样品空白孔、高LDH对照孔-高LDH对照空白孔、低 LDH对照孔-背景空白孔的吸光度后，算出各种孔的复孔平均值。

2、细胞损伤率/毒性根据如下公式算出。

3、细胞损伤率/死亡率/毒性(%)=[(ODA- ODc)/( ODB - ODc)]×100%

其中

1、ODA ：样品的吸光度（待测样品孔-样品空白孔)。

2、ODB ：高LDH对照的吸光度(高LDH对照孔-高LDH对照空白孔)。

3、ODc ：低LDH对照的吸光度（低LDH对照孔-背景空白孔)。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底.避免开盖时试剂损失。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。