中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒

细胞简介

中性红法细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒是利用细胞对中性红的摄入能力来检测细胞增殖或细胞毒性。中性红可以被活细胞所摄入，并在溶酶体中积累。在细胞增殖加快时，细胞数量增多，可以摄入的中性红的量就会增加。在细胞受到损伤时，中性红的摄入能力会下降。这样通过对于中性红摄入量的不同就可以确定细胞的增殖或毒性情况。

试剂盒组成

组份储存条件

染色液室温避光保存

【注】

低温保存后染色液可能出现结晶沉淀。

出现结晶可以37°C水浴溶解。

组份储存条件

室温避光保存

【注】

1、开盖后组份按要求条件保存。

2、拆封后请尽快使用完。

储存条件

2-8°C避光保存

有效期

一年

样本类型

1、悬浮细胞

2、贴壁细胞

仪器准备

1、带有540nm波长的酶标仪/分光光度计

2、CO2培养箱

3、离心机

4、移液器

5、冰箱

6、冰盒

试剂准备

1、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X)

( phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS:约含8mM Na2HPO4、2mM KHPO、137mMNaCl和3mM KCl

或者HBSS(Hank' s Balanced Salt Solution: With: Calcium Magnesium GlucoserWithout: Phenol Red.Components:CaCl=(anhydrous) 140mg/L(1.261mM) 、MgCl:-6HO100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L.(0.407mM)、Kcl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4。60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、 NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4.(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L.(5.556mM)

试剂准备

1、离心管

2、吸头

3、96孔培养板

使用注意事项

1、中性红染色液存放后会产生沉淀。出现结品可以37℃水浴后摇匀溶解。染液是过量的，也可以直接吸取染色液的上清液使用，也可以使用针头滤器等过滤去除沉淀后继续使用，不会影响使用效果。

2、96孔板在细胞培养过程中会存在蒸发问题。在加入中性红染色液前，如果培养液存在明显的蒸发问题，会影响细胞的生长状态，并严重影响后续的检测结果。

3、部分药物可能对检测有影响，有影响时需换液后检测，无影响时直接检测。用培养基或PBS来配制待检测药物，加入中性红试剂，测药物溶液在540 处的吸光度。如果该吸光度与不含药物仅加中性红试剂的培养基或PBS吸光度差异不大，则可以直接加入中性红，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的4、200ul培养基和20ul中性红进行检测。

5、如果样品为高浑浊度的细胞悬液，或者为了去除其它颜色物质的影响，建议设定690 nm作为参比波长，以OD540扣除参比波长的0.D值即可。

加中性红后孵育时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，对于大多数情况孵育2小时即可，有些细胞需要培养较长时间。

5、检测贴壁细胞时，中间的换液、洗涤等步骤如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。部分细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基，此部分细胞对结果有显著影响，不可随意丢弃，需离心后收集与贴壁细胞一起检测，才能全面的反映出细胞的整体情况。

6、96孔板液体应使用移液器吸出，不可倾倒。一次处理过多的孔，加液时操作时间过长，可导致细胞干燥失水而死。悬浮细胞以及一些贴壁不牢的细胞会因倾倒而丢失。

以下以96孔板每孔200ul为例，如果不是使用96孔板检测，中性红溶液的用量相应等比例增加即可。

活性测定使用方法

1、收集细胞，加细胞悬液100 ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充)。每板设对照（加100pul培养基)。

2、置37C，5%COz孵育过夜，倒置显微镜下观察。3.每孔加入10 ul待检测药物溶液，37°C孵育。

3、每孔加入10 ul待检测药物溶液，37℃孵育。

【注】

1、此处以药物处理细胞为例，实际以自己的细胞样品为准。

2、用各种方法制备的细胞模型按下面方法加入 MTS试剂后检测即可。

3、每孔加入10 ul MTS溶液，37°C孵育1-4小时。

【注】

1、此处以96孔板加样为例，实际检测时以自己的细胞培养容器为准。

2、按培养基的用量的10%比例添加中性红试剂即可。

3、如果培养基中的药物不会对后续检测产生干扰，直接加入20微升中性红染色液;如果培养基中的药物可能会对后续检测产生干扰，先用PBS、DPBS或HBSS等适当溶液洗涤1-2次，随后加入200微升新鲜的细胞培养基，并加入20微升中性红染色液。

4、一般⒉小时即可。对于细胞密度非常低，细胞代谢速率非常慢的情况，可以把孵育时间延长到3-4个小时。

5、染色后可以在显微镜下检测细胞状态，细胞内应看到喑红色膜泡，如果显微镜有黄色滤光片，可看到更清晰的亮红色膜泡。

6、移除含有中性红染色液的细胞培养基，用PBS、DPBS或 HBSS等适当溶液洗涤1-2

次

【注】

1、检测贴壁细胞时，中间的换液、洗涤等步骤如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。部分细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基，此部分细胞对结果有显著影响，不可随意丢弃，需离心后收集与贴壁细胞一起检测，才能全面的反映出细胞的整体情况。

加入200微升中性红检测裂解液，室温摇床上裂解20 分钟。在摇床上摇动可以促进样品的裂解。

2、测定540 nm各孔的吸光值。

3、同时设置空白孔（培养基和中性红溶液，无细胞)，对照孔（不加药培养基和中性红溶液，有细胞)，每组设定3-5复孔

【注】

1、复孔数量根据自己实际需要设定，为了降低试剂消耗成本，可以少设复孔。

结果分析

1、细胞活力计算

2、将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。

3、细胞活力%=(加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD) ×100。

注意事项

1、正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

2、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损。

3、禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

4、样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

5、最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

6、实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。